生物影响评价与生物相容性测试

　　概念：生物相容性也可以叫作生物影响评价，生物相容性是关系到在各种情况下的生物材料的行为。该术语是指一种材料与在特定情况下合适的宿主响应于执行的能力。该术语的含糊不清反映了对生物材料如何与人体相互作用以及Zui终这些相互作用如何决定医疗设备临床成功的见解的不断发展。现代医疗设备和假肢通常由多种材料制成，因此仅讨论特定材料的生物相容性可能并不总是足够的。

　　为什么要做生物相容性测试？哪些产品需要做生物相容性测试？具体检测的指标是什么？

　　背景：对生物材料进行生物相容性的评价是进入临床实验前的重点研究内容，但是目前国内外标准的评价体系尚未完全建立，影响了生物材料的研究。

　　主要产品类型：

　　有源产品：任何依靠电能或者其他能源，而不是直接由人体或者重力产生的能量，发挥其功能的医疗器械。

　　有源器械的使用形式有：能量治疗器械；诊断监护器械；输送体液器械；电离辐射器械；实验室仪器设备、医疗消毒设备；其他有源器械或有源辅助设备等。

　　无源医疗器械：无源器械的使用形式有：药液输送保存器械；改变血液、体液器械；医用敷料；外科器械；重复使用外科器械；一次性无菌器械；植入器械；避孕和计划生育器械；消毒清洁器械；护理器械、体外诊断试剂、其他无源接触或无源辅助器械等。

　　以上均可进行生物相容性评价

　　生物相容性评价的实验方法：生物材料的评价途径生物材料的生物学评价通常包括体外和体内两种实验途径。

　　实验方法：

　　对生物材料生物相容性的评价主要包括血液相容性评价和组织相容性评价两种方法，前者表示材料与血液之间相互适应的程度，后者表示材料与除血液之外其他组织的相互适应程度。具体的实验方法包括：细胞毒性实验、血液相容性实验、遗传毒性和致癌实验、显性致死实验、植入实验(皮下植入实验、骨内植入实验)、过敏实验等。其中Zui常用的就是细胞毒性实验。

　　1.细胞毒性实验细胞毒性实验是指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性，是检测生物相容性的一种快速、价廉、重复性好的方法。细胞毒性与被测材料的量尤其是表面积有关。目前几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有细胞毒性，该实验方法的优越性已在国际上得到认可

　　具体包括以下几种方法：

　　琼脂覆盖法：琼脂覆盖法是一种半定量的测试方法，用生物材料或其提取物均可进行。其方法是将含有培养液的琼脂层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法的优点是适用于多种类型的材料，缺点是其敏感性受到试样溶出物在琼脂层上扩散程度的影响。此实验成功的技术关键是掌握好琼脂培养基的温度以及正确使用中性红染料。

　　分子滤过法：分子滤过法是通过评价生物材料对单层细胞琥珀酸脱氢酶活性的影响来检测细胞毒性的一种快速简便的方法。该方法能够同时观察生物材料的原发性及继发性细胞毒性，其优点是敏感可靠、易推广，适用于短期内评价有轻度毒性的生物材料，但它存在影响析出产物从材料中扩散的缺点。

　　同位素标记法：同位素标记法包括铬释放法、3 H-leucine掺入法、125I-UdR(脱氧尿嘧啶核苷)释放法、放射性核苷酸前体物掺入法等。此方法能够深入地了解细胞受生物材料毒性的影响而产生的分子水平的变化，但缺点是方法复杂，与其他体外评价方法无明显相关性，实验结果不仅容易受到多方面因素的影响，而且易造成放射性污染，不利于操作人员的健康。

　　流式细胞术：流式细胞术主要是用来分析单一的生物材料对体外培养细胞生物合成方面的影响。此技术利用鞘流原理使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按照重力方向流动，细胞被激光照射后发射荧光，利用检测器逐个对细胞的荧光强度进行测定。其定量分析是根据荧光粒子发出的光量子而定量的，从而使细胞DNA含量的测定准确、方便、快捷、便于分析，此技术已经被广泛的应用于免疫学、肿瘤学、血液学、体细胞遗传学等各种医学前沿领域，发展潜力较大。

　　色度法：

　　①四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)：MTT法是一种快速评定细胞毒性和细胞增殖的比色分析法，常用于细胞代谢和功能的测定。此方法是由Mosroam在1983年提出的，Zui初应用于免疫学领域，近几年才在生物材料的检测中应用。其基本原理是，线粒体李瑞，等.生物材料生物相容性的评价方法和发展趋势ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:ZLKHAH 5473 http://www.CRTER.org琥珀酸脱氢酶能够催化四甲基偶氮唑盐形成蓝紫色结晶物并沉积于细胞中，二甲基亚砜(DMSO)可使结晶物溶解显色，结晶物结晶形成数目的多少与活细胞的数目和功能状态呈正相关。该方法可以快速、准确、灵敏地反映出细胞增殖程度和材料对细胞造成的细胞毒性损害程度。近年来MTT法已经在实验中得到广泛的验证，如van Dijkhuizen-Readersma等应用MTT法对亲水与疏水的聚yimi酯高聚物进行了生物相容性的评价，所用标准为ISO 10993-5。Jin等在检测镍镉烤瓷合金的生物相容性时也采用了MTT法。

　　②乳酸盐脱氢酶效能测定：又称为LDH测定。LDH是一种存在于活细胞中稳定的胞质酶，其渗出增加提示细胞膜的稳定性遭到破坏。特定的细胞类型在特定的培养环境下每个细胞的LDH含量是恒定的，而LDH的含量受培养参数的影响(如pH值)。通过测定进入介质的LDH释放的渗透性能够检测细胞膜的完整性，LDH的活性可以反映细胞线粒体的代谢和功能状况，进而反映细胞活性。LDH在生物相容性的评价中被广泛应用，尤其是在现代毒物学测试中可以提供较MTT测试更有价值的信息。然而Issa等发现，MTT测试较LDH测试敏感，但两者均显示了相似的细胞毒性等级，所以在评价材料的细胞毒性影响方面两者结合应用将更有价值。

　　2.血液相容性实验血液相容性是生物材料与血液接触时对血液破坏作用的量度，包括是否能够导致血栓形成、红细胞的破坏、血小板的减少或激活；能否激活凝血因子和补体系统；能否影响血液中各种酶的活性；能否引起有害的免疫反应等。其中溶血实验可以作为体外细胞毒性实验的一个重要补充，如果材料有溶血作用，则提示材料可能具有细胞毒性。血液相容性的研究目前主要集中在补体、血小板、白细胞、凝血因子等方向。血液相容性实验对用于心血管体系的生物材料发展有着重要的作用，但由于血凝机制和体内环境的多变性及复杂性，故而要求通过体内和体外实验从凝血、血小板、血栓形成、血液学或免疫学等多方面对生物材料的相容性进行评价，但是具体评价方法和指标都未统一，更没有标准化。

　　3.遗传毒性和致癌实验遗传毒性和致癌实验是生物材料中Zui复杂的问题。在体外检测方法中常用Ames实验，这是一种由细菌介导的检测基因毒物的方法，也是检测基因突变Zui常用的方法。但是由于Ames实验菌种的变异，使实验结果的假阴性率不断增加，已由原来的10%增加到30%~40%，因此为了对遗传毒性和致癌性作出准确科学的评价，一般同时还需要进行体外染色体畸变实验和微核实验以便相互补充。在20世纪70年代初，由Heddle和Schmid利用啮齿类骨髓细胞建立了微核测定方法，目前许多国家和国际组织已将微核实验规定为安全性评价必做的实验。

　　4.植入实验植入实验包括皮下植入和骨内植入两种实验方法，是评价材料生物相容性和安全性的主要体内方法。该方法是通过将生物材料植入动物的合适部位(如皮下、肌肉)，在一定时期通过组织学切片观察组织的变化，植入物周围纤维包膜的形成常被认为是材料与机体组织之间的理想反应，是提示材料生物相容性良好的一个重要指标。皮下植入实验适用于评价长期与组织接触的材料对皮下组织的反应。材料与对照材料分别植入到相同年龄、性别、种属动物的同一部位，实验周期为4~12周。术后定期对动物的生物反应进行评价，包括大体观察和组织病理学评价。在长期皮下植入时，围绕植入物是否形成肿瘤是开发下一代人工器官及生物材料需要解决的一个问题。骨内植入实验是指在实验动物左右肢(一般选择股骨外侧或者胫骨内侧)的同一位置处一侧放置实样，另一侧放置对照样本。实验期内观察动物并记录异常表现，实验完毕后对植入体周围组织进行生物反应评价。

　　5.过敏实验在动物腹腔内注射一定剂量的浸提液，每次注射后观察15 min，特别是注意观察末次注射后有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、尿便失禁、休克、死亡等反应。必须设立阳性对照组，并且保证遵循随机化原则。

　　生物相容性用途:生物物材料必须具有良好的生物相容性才能确保临床应用的安全性。生物材料不引起明显的临床反应以及能耐受宿主各系统的作用而保持相对稳定、不被破坏和排斥的生物学性质则为生物相容性良好。生物相容性的评价是生物材料进入临床实验前必不可少的关键环节。随着分子生物学的迅速发展，生物材料生物相容性的评价方法研究手段逐渐多样化，其评价已从整体、细胞水平进入了分子水平。

　　参考中国组织工程研究与临床康复第15卷第29期2011–07–16出版中，李瑞、王青山的《生物材料生物相容性的评价方法和发展趋势》